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1摘要

本文探讨性讲述了在进行原料药含量测定、原料药杂质定量测定、化药制剂含量测定、化药制剂杂质定量测定、化药制剂溶出度测定和中成药主成份含量测定的方法验证时，回收率考察的各种方法；如何去设计实验更合理，更能满足真正意义上的准确度要求；如何真正搞明白回收率考察的方法和意义。回收率是表示测定方法准确度的直观指标，指采用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度。任何分析方法，只要是定量测定，都必须满足一定的准确度要求，这是保证分析方法所测定数据可靠性的基本准则。对于药企的分析工作者，经常接触的是原料药、化药制剂和中成药相应的定量测定。笔者根据过往经历、所见所闻及国内外指导原则，分别就这几方面谈一谈回收率考察的各种方法。

2原料药含量测定

15版药典9101“药品质量标准分析方法验证指导原则”：原料药采用对照品进行测定，或用本法所得结果与已知准确度的另一个方法测定的结果进行比较。也可由所测定的精密度、线性和专属性推算出来。

ICHQ2中提及了三种方法。这三种方法与上述指导原则如出一辙，显然，CDE完全借鉴了ICH的指导原则。

几种回收率考察方法：

• 由所测定的精密度、线性和专属性推算出来。其实仔细想一下精密度项下的“重复性”，有种方式也是设计3种不同浓度，每种浓度分别制备3份供试品测定，用9份样品的测定结果进行评价。如此，对于原料药，重复性考察不就是回收率考察吗。因此，无需验证准确度。

• 用本法所得结果与已知准确度的另一个方法测定的结果进行比较。如原料含量的药典方法为滴定法（容量法），则开发的HPLC含量测定方法，其测定的结果与容量法比较，回收率% = HPLC含量/容量法含量×100%。

• 用对照品配制80%、100%和120%浓度的样品(含量测定时供试品原料的浓度作为100%浓度)，各个浓度平行配制三份，共九份样品。测得样品的峰面积，按照分析方法规定的计算方法计算（单点外标或多点外标），求得相应的量，作为测得量。配制样品时的称量作为加入量，回收率% = 测得量/加入量×100%。

• 加标法，类似化药有关物质杂质加标的方式，分别加入相对于供试品原料浓度的80%、100%和120%的对照品，每个浓度平行试验三份，共九份样品。回收率% = （测得量-样品中量）/ 加入量×100%。

上述几种方法，笔者更倾向于前三种方法，其中第二种最可靠，毕竟是采用两种不同原理方法测定结果的比较。

3药杂质定量测定

原料药杂质定量测定的回收率考察，毋庸置疑，肯定采用加标法。一般加入浓度分别为定量限浓度、限度的50%、限度的100%和限度的150%。每个浓度平行配制三份，分别计算每个浓度平行样品回收率的RSD和共计12份样品回收率的RSD。

回收率% = （测得量-样品本底）/ 加入量×100%。

注意，定量限浓度的回收率笔者认为还是必须要做的，有些公司这个浓度没有去考察。既然是“定量”限，就得满足一定的准确度要求，定量限浓度也要能准确定量，尤其当报告限等于定量限时，更得考察了。

曾经听到过这样的疑问，例如样品本底中杂质A的限度为0.5%，本底中的量为0.2%（本底量为限度的40%），加入限度的50%、100%和150%杂质对照品后，样品中的杂质A总量为0.45%、0.7%和0.95%，这样验证的实际浓度是限度的90%、140%和190%，那是不是需要在加标的时候考虑本底的量使加入后总量为限度的50%、100%和150%？此例加入量就变为加入限度的10%、60%和110%。

笔者认为，完全没有必要这样做，这种加标回收，测定的是加入量的回收率，如加入限度的50%，如回收率100%的话，那应该能回收限度50%的量。从回收率的计算公式“（测得量-样品中量）/ 加入量”，显然也是对“加入量”的回收率。况且，我们选取的这几个浓度，代表了一个浓度范围，也就是说我们验证了一个浓度范围，在这个范围内回收率均是可以接受的。只不过在进行线性考察时，线性范围要尽量宽，至少应覆盖回收率考察的浓度范围，此例的线性考察范围就应该是定量限浓度～限度浓度的2倍。

4化药制剂含量测定和杂质定量测定

化药制剂的含量测定和杂质定量测定的回收率考察，如果按照指导原则，其实都算是空白辅料加标。（注：2020版药典方法验证指导原则征求意见稿中，对于化药制剂，含量测定除了空白辅料加标，还可制剂加标；杂质测定已改成制剂加标）

化药制剂含量测定，是将对照品或原料加入空白辅料中，加入量为80%、100%和120%，考察在原料与辅料共存时，方法能检出其中主药的能力，每个浓度平行试验三份，其中每份空白辅料量是制剂处方中辅料占比的量，样品处理方式同供试品处理方式。

化药制剂杂质定量测定回收率的一种方式，是将杂质对照品加入制剂供试品中，一般加入浓度分别为定量限浓度、限度的50%、限度的100%和限度的150%。每个浓度平行配制三份，分别计算每个浓度平行样品回收率的RSD和共计12份样品回收率的RSD。回收率% = （测得量-样品本底）/ 加入量×100%。

化药制剂杂质定量测定回收率的另一种方式，是将杂质对照品加入空白辅料中（该法适用于供试品本底杂质含量较高的品种），加入量同上，回收率% = 测得量/加入量×100%。

5 化药制剂的溶出度测定

化药制剂溶出度测定的回收率考察方法跟其含量测定的方法类似。是将对照品或原料加入空白辅料中，加入量一般为50%、80%和100%，考察在原料与辅料共存时，方法能检出其中主药的能力，每个浓度平行试验三份，其中每份空白辅料量是制剂处方中辅料占比的量。

试验时一般将称量的样品置容量瓶中进行考察；也有将称量的样品置溶出杯中进行考察的；甚至还有将原辅料按处方比例称量，混合后装入胶囊，再将胶囊置溶出杯中进行考察，那片剂怎么办？难道还要将原辅料按处方比例称量，混合后压片吗？药检所进行质量标准复核时，一般是采用第一种方式，也曾听北京药检所的某位老师说溶出度的验证是针对溶出量的检测方法（如HPLC法）进行考察。如果针对溶出度测定方法（跟溶出仪相关）进行验证，那模拟样品是绝对不可能完全模拟实际样品的，实际样品中的原辅料还要经过一系列工艺过程呢。笔者更倾向于第一种方式，第二种方式也曾经采用过（特殊情况下），审评中心的卡培他滨片CTD案例也是采用第一种方式。

6中药材或中成药主成份含量测定

中成药是由多种药材或多种药材的提取物混合组成的，测定其中主要成份的回收率考察也是采用加标回收，一般加入该药中主要成份含量的50%、100%和150%的对照品，每个浓度也是平行试验三份。中成药主成份含量测定的前处理过程比较复杂，加入对照品后，处理过程跟供试品的处理过程完全一致。注意，一定要加入对照品后，再经过同样的处理过程，而不是供试品经处理后再加入对照品，只有前者才能真正地考察加入对照品后的供试品经过一系列复杂的处理过程后，能回收得到多少量。回收率% = （测得量-样品本底）/ 加入量×100%。

7回收率的引申概念

回收率的引申概念，生物样品的测定，如血浆样品中主药测定的方法验证引入了相对回收率和绝对回收率的概念，我们平时所说的回收率大部分是指绝对回收率。对于血样的绝对回收率，相当于血样中主药的提取率，一般都很低，要求50%以上即可。相对回收率的一般做法，在空白血浆中加入系列浓度的对照品储备溶液，制得校正曲线；在空白血浆中加入低、中、高浓度的对照品储备溶液，制得模拟含药血样，模拟血样中的主药含量通过校正曲线计算得到。回收率% = 测得量/ 加入量×100%，如此测得的相对回收率比绝对回收率数据好看多了，接受标准为80～120%，一般都能做到95～105%。服药采血后的血样当然也是通过校正曲线（基质加对照品储备液）计算其主药浓度。通过此例，可以看出，由于血浆中主药的提取率很低（绝对回收率），因此对照品溶液也同样加入空白血浆处理，这样就消除了提取率低的问题，也相当合理。鉴于此，笔者有个大胆想法，我们平时遇到样品基质很复杂的制剂，提取率怎么处理都很难提高，像这种样品，我们不妨可以采用相对回收率的处理方式，这样可以解决由于基质对样品的吸附作用而造成的绝对回收率低的问题。

本文仅代表个人观点和感悟，如有不当之处，还望各位同仁多多包涵。

参考文献

[1]  2015版药典四部9101. 药品质量标准分析方法验证指导原则.

[2] ICH Q2. VALIDATION OF ANALYTICAL PROCEDURES: TEXT AND METHODOLOGY.

[3]  CDE. 化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则.

[4]  2020版药典四部9101. 药品质量标准分析方法验证指导原则的征求意见稿.

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